А. Н. Захватов, А. Н. Беляев, Н. А. Аткина
ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени. Н.П. Огарева», Медицинский институт, Саранск
Информация об авторах:
Захватов Алексей Николаевич – доцент кафедры общей хирургии имени профессора Н.И. Атясова Медицинского института ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева» (Россия, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Победы, д.14), кандидат медицинских наук, +7 (917) 072-87-83, e-mail: zachvatan78@mail.ru
Беляев Александр Назарович – заведующий кафедрой общей хирургии имени профессора Н.И. Атясова Медицинского института ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева» (Россия, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Победы, д.14), профессор, доктор медицинских наук e-mail: belyaevan@mail.ru.
Аткина Наталья Алексеевна – студентка 5 курса Медицинского института ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева» (Россия, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Победы, д.14) e-mail: nata.atkina@yandex.ru.
В статье рассматривается возможность комбинированного применения нестероидной противовоспалительной терапии нимесулидом и внутрисуставного введения этоксидола. Изучено их влияние на процессы перекисного окисления липидов и метаболизм коллагена при экспериментальном посттравматическом артрите. Полученные в процессе исследования результаты обосновывают сочетанное применение данных препаратов при экспериментальной травме сустава.
Ключевые слова: посттравматический артрит, перекисное окисление липидов, оксипролин, коллаген, нимесулид, этоксидол.
Введение
В настоящее время многих исследователей беспокоит проблема травматических повреждений крупных суставов, несмотря на разнообразие современных методов лечения [1]. Повреждение суставного хряща является пусковым фактором, активирующим цепь последовательных воспалительных изменений в травмированном суставе [2]. Важное место в патогенезе посттравматического остеоартроза отводится активации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), продукты которого участвуют в формировании дегенеративнодистрофических изменений всех компонентов сустава [3]. Мигрирующие в очаг воспаления активированные нейтрофилы и макрофаги, способствуют избыточному накоплению активных форм кислорода, образующихся в результате деструкции хондроцитов и последующего высвобождения митохондриальных ферментов. Они, воздействуя на полиненасыщенные жирные кислоты клеточных мембран, запускают цепь реакций ПОЛ, что в конечном итоге способствует развитию оксидативного стресса [4]. Повреждающему действию свободных радикалов препятствует антиоксидантная система (АОС) организма, включающая низкомолекулярные антиоксиданты и антиоксидантные ферменты. В условиях оксидативного стресса происходит нарушение функционирования ферментов АОС, вследствие чего возникают и накапливаются окислительные повреждения, усугубляющие деструкцию хондроцитов и межклеточного матрикса суставного хряща [5]. На фоне деструктивных процессов так же наблюдается нарушение метаболизма коллагена в результате дисфункции синтетических процессов хондроцитов, проявляющееся синтезом структурно неполноценного короткоцепочечного фибриллярного коллагена, что препятствует нормальной репарации хрящевой ткани [6]. Оксипролин является специфической аминокислотой коллагена, поэтому может выступать в роли маркера катаболизма этого белка. Так, маркером деградации соединительной ткани служат свободный (СО) и пептидносвязанный оксипролин (ПСО), а процессы ее синтеза сопровождаются увеличением количества белковосвязанного оксипролина (БСО) в сыворотке крови. [7].
Учитывая патогенетические механизмы развития острого асептического посттравматического артрита, наиболее целесообразным в комплексном лечении данной патологии является внутрисуставное введение этоксидола, так как он обладает широким спектром воздействия, оказывая мембранопротекторное действие, оптимизирует прои антиоксидантные системы, улучшает микроциркуляцию, в комбинации с нимесулидом, оказывающим противовоспалительный эффект.
Цель исследования: изучение влияния перорального применения нимесулида в комбинации с внутрисуставным введением этоксидола на процессы ПОЛ, активность эндогенной АОС и некоторые показатели обмена коллагена при экспериментальном посттравматическом артрите.
Материалы и методы
Эксперименты проведены на 105 белых нелинейных крысах обоего пола массой 180-200 г., содержавшихся в стандартных условиях вивария ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарева». Протокол экспериментов был составлен в соответствии с Конвенцией по защите животных, используемых в эксперименте и других научных целях (принятой Советом Европы в 1986 г.), с приказом МЗ РФ No 267 от 19.06. 2003 «Об утверждении правил лабораторной практики»; он соответствует требованиям Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным (2000 г.), одобрен локальным этическим комитетом ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарева».
Животные были разделены на 4 серии. Первую серию составили интактные животные в количестве 15 крыс. В контрольной (30 животных) и опытных сериях под ингаляционным наркозом моделировали повреждение коленного сустава механическим путем в модификации Г. М. Дубровина [8]. Во II контрольной серии лечение не проводилось. Животным III серии (30 крыс), начиная со дня моделирования травмы, проводился курс лечения нимесулидом через зонд в среднетерапевтической дозе 2 мг/кг ежедневно в течение 10 дней. На животных IV серии (30 крыс) изучалась эффективность комбинированного перорального введения нимесулида в дозе 2 мг/кг ежедневно 1 раз в день в течение 10 дней и внутрисуставной терапии этоксидолом в дозе 5 мг/кг через день в количестве 5 инъекций. На данную методику получен патент на изобретение No 2516951 от 26.03.14 г. Для исследования от животных получали периферическую кровь.
Для оценки интенсивности процессов ПОЛ определяли уровень диеновых конъюгатов, малонового диальдегида при спонтанной (МДА) и железоиндуцированной (Fe-МДА) липопероксидации в эритроцитах и плазме. О состоянии АОС судили по уровню активности каталазы в плазме и эритроцитах и супероксиддисмутазы (СОД) в плазме.
Оценку метаболизма коллагена проводили по содержанию свободного (СО), пептидносвязанного (ПСО) и белковосвязанного (БСО) оксипролина в сыворотке крови по методу П.Н. Шараева [9]. На методику определения интенсивности деструктивных процессов в суставе нами получен патент на изобретение No 2463000 от 10.10.2012 г.
Животных выводили из эксперимента на 28 сутки наблюдения. Статистическая обработка результатов исследований проведена с помощью t-критерия Стьюдента. Изменения считали достоверными при р меньше 0,05 (0,01; 0,001).
Результаты и их обсуждение
Моделирование травматического повреждения коленного сустава приводит к активации свободнорадикальных процессов ПОЛ, проявляющееся многократным повышением первичных и вторичных продуктов липопероксидации в крови лабораторных животных, высокий уровень которых оставался на протяжении всего эксперимента. Так, концентрация МДА плазмы и эритроцитов превышала аналогичные данные интактной серии на 101,17% (p<0,001) и 72,85% (p<0,001) соответственно, Fe-МДА был выше должных величин в плазме на 112,06% (p<0,001), в эритроцитах на 82,22% (p<0,001). Показатель первичных продуктов ПОЛ диеновых конъюгатов превышал исходные цифры на 118,75% (p<0,05). Активность каталазы в плазме и эритроцитах к концу эксперимента оставалась в состоянии угнетения относительно показателей интактной серии в 2,26 раза (p<0,001) и в 2,04 раза (p<0,001). СОД в плазме была меньше уровня исходного значения в 2,51 раза (p<0,001). Высокая активность процессов свободнорадикального окисления и низкий антиоксидантный потенциал свидетельствует о необходимости медикаментозной коррекции развивающегося дисбаланса ПОЛ.
При пероральном введении нимесулида наблюдалась положительная достоверная динамика снижения содержания продуктов ПОЛ: МДА и Fe-МДА плазмы составили 9,17±0,41 мкмоль/л и 19,86±1,15 мкмоль/л соответственно, что было ниже значений контрольной серии на 11,14% (p1<0,05) и 10,38% (p1<0,05). Выявлено статистически значимое снижение МДА в эритроцитах при спонтанном окислении липидов на 11,06% (p1<0,05), а при железоиндуцированном окислении – на 11,97% (p1<0,05). При этом концентрация в плазме МДА и Fe-МДА была выше показателя интактных животных в 1,79 (p<0,001) и 1,99 раза (p<0,001), в эритроцитах в 1,54 (p<0,001) и 1,60 раза (p<0,001) соответственно. Так же сохранялся высокий достоверно не изменяющийся уровень диеновых конъюгатов, превышавший норму в 1,94 раза (p<0,001). При сравнении с соответствующими показателями контрольной серии наблюдалось увеличение уровня каталазы в плазме крови на 22,0% (p1<0,05), в эритроцитах на 21,92% (p1<0,05), а СОД – на 25,49% (p1<0,05) соответственно. Но, несмотря на определенный рост показателей АОС, их содержание было значительно ниже исходного уровня: активность каталазы в плазме в 1,85 раза (p<0,001), каталазы в эритроцитах в 1,68 раза (p<0,001), супероксиддисмутазы в плазме в 2,0 раза (p<0,001) соответственно.
На фоне комбинированного введения этоксидола и НПВП относительно данных контрольной серии уровень МДА плазмы и эритроцитов снизился на 45,63% (p1<0,001) и 38,42% (p1<0,001) соответственно. Показатели Fe-МДА плазмы и эритроцитов уменьшились на 47,11% (p1<0,001) и 41,95% (p1<0,001), уровень диеновых коньюгатов на 48,57% (p1<0,001), соответственно. Показатели активности АОС были выше, чем у животных контрольной серии: каталаза в плазме на 98,00% (p1<0,001), каталаза в эритроцитах – на 93,86% (p1<0,001). Концентрация СОД увеличилась в 2 раза (p1<0,001). Относительно данных серии с нимесулидом при комбинированном введении НПВС и этоксидола МДА плазмы и эритроцитов снизились соответственно на 38,82% (p2<0,001) и 30,75% (p2<0,001). Уровень Fe-МДА плазмы и эритроцитов был ниже на 40,99% (p2<0,001) и 34,02% (p2<0,001) соответственно. Показатель диеновых коньюгатов снизился на 41,94% (p2<0,001) (табл. 1). Изменения антиоксидантной системы проявились увеличением активности каталазы плазмы и эритроцитов на 62,3% (p2<0,001) и 58,99% (p2<0,001) и ростом СОД на 59,38% (p2<0,001) (табл. 2).
При моделировании травматического повреждения коленного сустава в контрольной серии наблюдалось развитие дисбаланса метаболизма коллагена, характеризующееся повышением уровня СО в 2 раза (p<0,001), и значительным ростом ПСО и БСО в 5,3 (p<0,001) и 2,42 (p<0,001) раза относительно животных интактной серии. Наблюдалось повышение коэффициента ПСО/СО на 155,5% над должными значениями.
Применение нестероидной противовоспалительной терапии способствовало ограничению роста СО в сыворотке крови относительно данных контрольной серии на 13,07% (p3<0,01), ПСО на 47,84% (p3<0,001). Наблюдался рост величины БСО до 91,75±1,20 мкмоль/л, однако это было ниже контрольного значения на 25,96% (p3<0,001). Показатель отношения ПСО/СО снижался на 36,96% (p3<0,001) относительно контрольной серии. При сравнении с должными величинами к концу эксперимента фракция свободного оксипролина была выше на 79,11% (p<0,001), пептидосвязанный и белковосвязанный оксипролин на 176,68% (p<0,001) и 79,01% (p<0,001) соответственно. Показатель ПСО/СО превышал значение интактных животных на 53,70%.
При комбинированном лечении нимесулидом и этоксидолом фракции оксипролина в сыворотке крови по сравнению с данными контрольной серии изменились следующим образом: СО снизился на 50,19% (p3<0,001), ПСО – на 79,19% (p3<0,001), БСО – на 54,70% (p3<0,001), ПСО/СО – на 60,14% (p3<0,001) (табл. 3).
Обсуждение
В ходе исследования установлено, что процессы свободнорадикального окисления играют важную роль в патогенезе посттравматического артрита, способствуя усилению процессов деструкции и нарушению репаративных возможностей коллагенового каркаса хрящевой ткани. Моделирование посттравматического артрита коленного сустава приводит к развитию дисбаланса метаболизма коллагена, характеризующегося значительным повышением СО и ПСО в сыворотке крови, свидетельствующих о деструкции соединительной ткани. На фоне продолжающихся деструктивных процессов коллагена происходит резкий рост белковосвязанной фракции оксипролина, определяющий высокую активность неполноценного фибриллогенеза, приводя к избыточному накоплению соединительной ткани с развитием склерозирования хряща и субхондральной кости.
Применение комбинированного введения этоксидола и нимесулида способствовало снижению интенсивности процессов липопероксидации и росту антиоксидантной активности ферментов, приближая их уровень к концу эксперимента к интактным значениям. Параллельно к концу эксперимента происходило коррекция нарушений обмена коллагена катаболической и синтетической направленности, определяемые снижением уровня всех фракций оксипролина, что отражает подавление процессов деструкции и избыточной пролиферации соединительной ткани в пораженном суставе.
Таким образом, полученные результаты показывают обоснованность комбинированного применения нестероидной противовоспалительной терапии и внутрисуставного введения этоксидола.
Выводы
1. Травматическое повреждение сустава приводит к резкому росту процессов ПОЛ и угнетению активности АОС, приводящих к усилению деструктивных процессов коллагеновых биополимеров соединительной ткани, являющихся основным каркасом внеклеточного матрикса суставного хряща.
2. Пероральное введение нимесулида в сочетании с внутрисуставным введением этоксидола к концу эксперимента способствовало значительному снижению продуктов липопероксидации, уменьшая свободнорадикальную биодеструкцию коллагеновых волокон и блокируя избыточную пролиферацию соединительной ткани, предупреждая развитие дегенеративнодистрофических изменений и доказывая, тем самым, целесообразность сочетанного применения данных препаратов.
Список литературы
1. Котельников Г. П. Остеоартроз: руководство / Г. П. Котельников, Ю. В. Ларцев. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. – 208 с. 2. Куликов В. Ю. Роль окислительного стресса в регуляции ме
таболической активности внеклеточного матрикса соединительной ткани (обзор) / В.Ю. Куликов // Медицина и образование в Сибири. – 2009. – No4. – C. 5.
3. николаев С. М. Свободнорадикальное окисление и скрининг антиоксидантов, адаптогенов с использованием биотестсистем / С. М. Николаев, Л. Н. Шантанова, А. Г. Мондодоев и др. // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. – 2010. – No2(72). – С. 196–200.
4. Ziskoven C. Oxidative stress in secondary osteoarthritis: from cartilage destruction to clinical presentation? / C. Ziskoven, M. Jäger, C. Zilkens et al. // Orthopedic Reviews. – 2010. – Vol. 2. – N 2. – P. 95–101.
5. Рязанцева Л. Т. Ферменты-антиоксиданты: структурнофункциональные свойства и роль в регулировании метаболических процессов / Л. Т. Рязанцева // Вестник Воронежского государственного технического университета. – 2011. – Т. 7, No2. – С. 126–129.
6. Любарский М. С. Особенности хондроцитов суставного хряща при гонартрозе / М. С. Любарский, Н. П. Бгатова, Н. Р. Мустафаев // Успехи современного естествознания. – 2010. – No11. – С. 75–76.
7. Власов М. Ю. Влияние внутримышечных инъекций гидроксиапатита на обмен коллагена / М. Ю. Власов // Вестник СамГМУ. Естественнонаучная серия. – 2002. – No4. – С. 157–161.
8. Дубровин Г.М. Обоснование применения миелопида для профилактики посттравматического остеоартроза (экспериментальное исследование) / Г. М. Дубровин, Ю. А. Блинков, С. В. Нетяга, А. А. Нетяга // Вестник травматологии и ортопедии им. Н. Н. Приорова. – 2005. – No 2. – С. 60–62.
9. Шараев П. н. Методы исследования обмена коллагена в клинике / П. Н. Шараев // Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии: Материалы конференции биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири. – Ижевск. – 2001. – С. 150–153.
CORRECTION PROCESSES OF FREE RADICAL OXIDATION AND METABOLISM OF COLLAGEN OF ARTICULAR CARTILAGE IN EXPERIMENTAL KNEE JOINT INJURY
Information about authors:
A. N. Zahvatov, A. N. Belyaev, N. A. Atkina
MSU OGAREVA, Medical Institute, Saransk
Alexey Zahvatov – Associate Professor, N.I. Atyasov Department of General Surgery of N.P. Ogarev State Medical University (14, str. Pobeda, Saransk, Russian Federation), PhD in Medical Science, +7 (917) 072-87-83, e-mail: zachvatan78@mail.ru
Alexander Belyaev – Chief of Dept. N.I. Atyasov Department of General Surgery of N.P. Ogarev State Medical University (14, str. Pobeda, Saransk, Russian Federation), Professor, PhD in Medical Science.
Natalya Atkina – student (5th acad. year) of N.P. Ogarev State Medical University (14, str. Pobeda, Saransk, Russian Federation).
In the article a possibility of using of non-steroidal anti-in ammatory therapy and intra-articular administration nimesulid and intraarticular etoxidol. Studied their e ect on lipid peroxidation and collagen metabolism in experimental post-traumatic arthritis. e results obtained in the course of research results prove the validity of the combined use of these drugs in experimental injury to the joint.
Key words: post-traumatic arthritis, lipid peroxidation, hydroxyproline, collagen, nimesulid, etoxidol.